Меню Рубрики

Получение сыворотки крови для серологических и биохимических исследований

Кровь представляет собой соединительную ткань, состоящую из жидкой среды, иначе называемой плазмой, клеток в ней, представленных лейкоцитами, а также структур без ядра – эритроцитов и тромбоцитов. Она осуществляет ряд жизненно важных для организма функций:

— обогащает клетки кислородом;

— способствует обогащению тканей питательными веществами;

— регулирует температуру организма;

— защищает от бактерий, вирусов и грибков.

Плазма является жидким бесцветным раствором крови, имеющим сложный состав, в котором растворены все питательные вещества организма. Она состоит на 90% из воды и на 10% из форменных элементов, представленных в виде белков, липидов, углеводов и минеральных веществ. Плазма способствует разжижению крови и делает ее консистенцию оптимальной для того, чтобы транспортировать важные питательные элементы и вещества ко всем клеткам организма.

Если из плазмы удалить фибриноген, компонент, отвечающий за свертываемость крови, то получится сыворотка крови. Она применяется для переливания после хирургического вмешательства, а также в акушерстве и гинекологии.

Это жидкость желтоватого цвета, отделенная от кровяного сгустка. Ее специфический цвет свидетельствует о наличии в ней жёлчного пигмента – билирубина. Применяется для биохимических анализов, исследования на наличие разного рода инфекционных заболеваний, для оценивания результативности вакцинации. Сыворотка крови человека или животного, иммунизированная определенным антигеном, может стать иммунной сывороткой, применяемой для диагностики и лечения ряда болезней. Ее также применяют для определения группы крови. Для клинических практик используют свежую или предварительно замороженную кровяную сыворотку.

Сыворотка крови может быть получена несколькими способами:

— В термостате, куда помещается стерильно взятая кровь на полчаса. После этого при помощи пипетки отслаивается сгусток от стенки пробирки и размещается в холодильнике. Оставшаяся сыворотка сливается или отсасывается в стерильную пробирку.

— Путем нейтрализации элементов фибриногенов с помощью ионов кальция, за счет чего резко увеличивается стабильность.

— Путем естественного свертывания получают так называемую нативную сыворотку.

Анализ сыворотки крови можно осуществить путем биохимического анализа, что позволяет понять, как работают внутренние органы. Стандартный анализ показывает состояние и количество белков, углеводов, липидов, минерального обмена. Кровь для исследования берется из вены, объем составляет в среднем 5 мл. Сдается сыворотка крови утром, на голодный желудок, то есть нельзя есть или пить за 12 часов до забора кроки. За 14 дней до сдачи необходимо приостановить прием препаратов, действие которых направленно на снижение количества жиров.

Правильная трактовка полученных результатов анализа и знание стандартных показателей дает возможность четко установить все дисбалансы, нарушения и воспалительные процессы в организме и расскажет о состоянии внутренних органов.

Исследование сыворотки крови начинается со сдачи общего анализа. Анализ на общий белок покажет количество всех белков (альбумина и глобулина), содержащихся в сыворотке. Норма белков и аминокислот для младенцев до 1 месяца колеблется в пределах 46,0 – 68,0 г/л, для детей до года – 48,0 – 76,0 г/л. Белки сыворотки крови для детей в возрасте до 16 лет должный иметь показатели 60,0-80,0 г/л, у взрослых – 65,0-85,0 г/л.

Количество белка может меняться в зависимости от положения тела и физической активности. При подъеме тела количество белков увеличивается на 10% в течение получаса, активная физическая работа заставляет меняться показатели в пределах 10%. Пережатие вены и работа рукой в процессе забора крови могут также дать завышенные показатели.

Белки плазмы синтезируются клетками печени. Анализ показывает уровень содержания:

Анализ сыворотки крови покажет пониженное содержание белка, если возникает недостаточное его поступление в организм вследствие голодания или соблюдения диеты без белков. Причиной снижения уровня может послужить рак печени или другое воспалительное заболевание этого органа, новообразования, ожоги и другие заболевания, спровоцированные повышенной потерей белка. Также может быть нарушен процесс образования белка в организме, например, после длительного лечения кортикостероидами или как результат расстройства процесса всасывания из-за энтерита, энтероколита, панкреатита.

Последствием дегидратации после травмы или ожога может стать повышение концентрации белка. Возникновение острой инфекции приводит к повышению показателей, связанных с обезвоживанием организма. При этом уровень белков может нормализоваться самостоятельно, что будет свидетельствовать о процессе выздоровления.

Сыворотка для распознания группы крови должна быть стандартной, то есть определенной группы, приготовленной из человеческой крови. Для теста необходимо подготовить сухое предметное стекло, стандартную сыворотку трех групп крови, раствор хлорида натрия, вату, стеклянные палочки и пипетки. Предметное стекло разделяется на три сектора, куда помещают различными пипетками по капле сыворотки каждой из групп крови. Стеклянной палочкой капли взятой крови переносятся на тарелку рядом с сывороткой. Поочередно новыми палочками смешиваем кровь с сывороткой до получения однородного розового цвета. По истечении трех минут к каждой полученной смеси добавляем физраствор. Постоянно покачивая предметное стекло следим за реакцией. Уже в первые минуты положительной реакции должны просматриваться зернышки, представляющие собой склеенные эритроциты. Эти зернышки могут слиться в более крупные, а иногда положительная реакция может проявиться в виде хлопьев разной величины. При отрицательной реакции первоначальный розовый цвет смеси останется без изменений.

Читайте также:  Результаты биохимического анализа крови при циррозе печени показатели

Сыворотка крови — это не просто сложная смесь способная рассказать о состоянии организма, но и важный элемент большинства противовирусных лекарств.

По материалам www.syl.ru

Подготовка обследуемых

Взятие венозной крови производится натощак, в утренние часы. При взятии венозной крови необходимо учитывать ряд факторов которые могут повлиять на результат гематологических исследований: физическое перенапряжение (бег, быстрая ходьба, подъем по лестнице), эмоциональное возбуждение, прием пищи накануне исследования, купение, прием алкоголя и т.д. Для исключения этих факторов, следует соблюдать следующие условия подготовки пациентов:
• взятие венозной крови осуществляется после 15-минутного отдыха обследуемого;
• пациент во время взятия сидит, у тяжелых больных взятие крови может осуществляться лежа.
• курение, прием алкоголя и пищи непосредственно перед исследованием исключаются;

Основной способ взятия венозной крови для лабораторного исследования – пунктирование вены. Венозную кровь, как правило, забирают из локтевой вены. В случае необходимости ее можно получить из любой вены (запястья, тыла ладони, над большим пальцем и т.д.). У новорожденных и грудных детей кровь обычно берется из лобной, височной или яремной вены.
При взятии крови из вены необходимо избегать: мест шрамов, гематом; вен, используемых для переливания растворов; ножных вен (у больных диабетом, при нарушениях периферического кровотока, ангиопатиях).

Оборудование

Для венепункции можно использовать три варианта пункционных систем:
• одноразовые пластиковые системы (вакутейнеры), состоящие из контейнера с навинчивающейся на него одноразовой иглой и пробирки с плотно прилегающей пробкой и вакуумом внутри;
• одноразовые шприцы с подходящим диаметром иглы;
• иглы с внутренним диаметром 0,55-0,65 мм.

Условия транспортировки венозной крови

Правильно собранная венозная кровь должна быть своевременно доставлена в лабораторию. При комнатной температуре время доставки не должно превышать 60 мин после взятия крови. Если доставка крови в лабораторию осуществляется в течении дня, то она хранится при температуре +40С-+60С (в холодильнике) и далее в специальных транспортных контейнерах в ледяной бане доставляется в лабораторию.
Во время транспортировки пробирки и контейнеры с кровью должны быть соответствующим образом защищены от вредного воздействия окружающей среды и погодных условий. При транспортировке венозной крови должны строго соблюдаться правила техники безопасности, асептики и антисептики.
Пробирки должны быть промаркированы, упакованы и плотно закрыты. Упаковка должна быть удобной для транспортировки. Сроки хранения зависят от исследуемого показателя, температуры хранения и антикоагулянта, с помощью которого осуществляется взятие крови.

Методика получения сыворотки крови (без использования разделительных или вспомогательных средств для центрифугирования)

Оборудование
1. Центрифужные стеклянные пробирки общим объемом 10-12 мл.
2. Стеклянные палочки или Пастеровские пипетки с запаянными на конце капиллярами (для отделения сгустка).
3. Центрифуга лабораторная (до 3000 об/мин).

Венозная кровь, полученная без антикоагулянтов в центрифужную стеклянную пробирку, отстаивается в ней при комнатной температуре (15-200С) в течение 30 минут до полного образования сгустка. По окончании образования сгустка пробирки открывают и осторожно проводят тонкой стеклянной палочкой или запаянным капилляром Пастеровской пипетки по внутренним стенкам пробирки по окружности в верхнем слое крови для отделения столбика сгустка от стенок пробирки. Сыворотку сливают в другую центрифужную пробирку, придерживая сгусток стеклянной палочкой, и центрифугируют, либо центрифугируют в тех же, первичных, пробирках.

После ретракции сгустка пробы центрифугируют при относительной центробежной силе RCF от 1000 до 1200 xg (максимально до 1500 xg) в течение 10 минут.
В случае использования микропробирок и центрифуги для них центрифугирование проводят при 6000-15000 xg в течение 1,5 минут. После центрифугирования сыворотку сливают во вторичные (транспортные) пробирки. Сыворотка не должна быть гемолизированной.
Плазма получается из крови путем отделения клеток крови. Она представляет собой бесклеточную надосадочную жидкость, которая получается при центрифугировании крови, свертываемость которой ингибирована добавлением антикоагулянтов тотчас после взятия. В плазме содержатся факторы свертывания крови. В связи с тем, что плазма и сыворотка содержат около 93% воды, в отличие от цельной крови, которая содержит около 81% воды, концентрация компонентов в плазме на 12% выше, чем в цельной крови. Это может иметь принципиальное диагностическое значение при исследовании активности, например ЛДГ у которого наиболее высокая концентрация наблюдается в сыворотке крови, чем в плазме.
Широко применяются коммерческие системы для получения плазмы. Они представляют собой пробирки или устройства типа шприцев (“вакутейнер”) с вакуумом внутри, содержащие различные антикоагулянты и/или ингибиторы гликолиза. Как и в случае устройств для сыворотки, эти пробирки для плазмы имеют разные варианты, содержащие разделительные гели и гранулят из полистирола, ускоряющие получение плазмы, облегчающие транспортировку и хранение. В них уже имеются антикоагулянты и метки до которых следует набирать кровь.

Читайте также:  Определение пробы на индивидуальную совместимость крови донора и реципиента

Методика получения плазмы

Венозную кровь, полученную с антикоагулянтом немедленно после взятия перемешивают переворачиванием пробирок с кровью, закрытых крышками, не менее 5 раз. Перемешивание должно осуществляться без встряхивания и пенообразования. Время между началом наложения жгута и смешиванием крови с антикоагулянтом не должно превышать 2 минут.
После уравновешивания пробирок с кровью, их центрифугируют при RCF 1000-1200 xg, но не более 1500 xg, в течение 10-15 минут. Плазму немедленно сливают в транспортную центрифужную или химическую пробирку. Пробирку закрывают крышкой.
Условия транспортировки плазмы крови
Правильно полученная и собранная плазма крови должна быть своевременно доставлена в лабораторию. При комнатной температуре время доставки не должно превышать 24 часа. Если доставка плазмы в лабораторию осуществляется в течение дня, то она хранится при температуре +4. +80С (в холодильнике) и далее в специальных транспортных контейнерах в ледяной бане доставляется в лабораторию. Для более длительного хранения плазма может быть заморожена при температуре –200С.
Правила транспортировки плазмы такие же как и венозной крови.

По материалам www.analyz24.ru

При исследовании сывороток крови животных необходимо иметь в виду, что они могут содержать:

1) агглютинины к эритроцитам животных различных видов. Содержание их у разных животных различно. Из исследуемых сывороток их удаляют. Для этого сыворотки предварительно обрабатывают эритроцитами животных того вида, которых будут использовать в реакции. Так, при исследовании сывороток на наличие антител к вирусу ПГ-3 крупного рогатого скота в РТГА используют эритроциты морской свинки, сыворотки предварительно обрабатывают эритроцитами морской свинки (на 5 мл сыворотки 2—3 капли осадка эритроцитов, 20 мин встряхивают при 4 °С и центрифугируют, надосадочную сыворотку используют в реакции). При арбовирусных инфекциях в РТГА используют гусиные эритроциты, сыворотки предварительно обрабатывают гусиными эритроцитами;

2) неспецифические ингибиторы вирусов. Как и антитела, они являются гуморальным неспецифическим фактором иммунитета и нейтрализуют инфекционную и гемагглютинирующую активности вирусов. Свое действие на вирусы неспецифические ингибиторы проявляют не только в организме (in vivo), но и в пробирке (in vitro). Наличие этих ингибиторов в исследуемой сыворотке приведет к искажению результатов серологических реакций. Поэтому все исследуемые сыворотки перед реакцией предварительно освобождают от неспецифических ингибиторов различными методами. Ингибиторы можно разделить на две группы:

а) термолябильные (β-ингибиторы), которые удаляют путем прогревания сывороток в течение 30 мин при температуре 56— 63 °С (в зависимости от вида животного, от которого получена сыворотка). Перед прогреванием сыворотки разводят не менее чем в 2 раза физиологическим раствором во избежание их свертывания;

б) термостабильные (α-, γ-ингибиторы). Одни из них выдерживают нагревание до 75 °С, другие — до 100 °С. Методы освобождения от них разные и зависят от вида животного, от которого получена сыворотка, и от вируса, используемого в реакции. Наиболее широко в диагностических лабораториях используют следующие методы:

удаление ингибиторов углекислым газом (CO2). Для этой цели чаще используют аппарат Киппа. Углекислый газ пропускают в течение 5—7 мин через исследуемую сыворотку, разведенную 1:10 дистиллированной водой, затем центрифугируют 10 мин при 1500 мин -1 (об/мин) и затем к 0,9 мл надосадочной жидкости добавляют 0,1 мл 8,5%-ного раствора NaCl, прогревают 30 мин при 56 °С и используют сыворотку в реакции;

Читайте также:  Определения группы крови с использованием реакций абсорбции элюции

удаление ингибиторов перйодатом калия (KIO4). С этой целью к 1 части сыворотки добавляют 1 часть 1%-ного KIO4, выдерживают 2 ч при комнатной температуре, затем добавляют 2 объема 5%-ного раствора глюкозы и 2 объема физиологического раствора (разведение сыворотки 1 : 10);

удаление ингибиторов каолином. Для этого к 1 части сыворотки добавляют 1 часть 25%-ной взвеси каолина в физиологическом растворе, полученную смесь встряхивают, оставляют на 20 мин при комнатной температуре, затем центрифугируют (10 мин при 2000 мин -1 ). Надосадочнуто жидкость используют в реакции (разведение сыворотки 1:2);

существуют и другие методы (обработка сыворотки различными ферментами);

3) при постановке РСК необходимо учитывать, что сыворотки могут обладать антикомплементарной активностью, т. е. способностью связывать или разрушать комплемент и, следовательно, препятствовать гемолизу эритроцитов в индикаторной системе. Антикомплементарность может быть обусловлена: индивидуальными особенностями животного; наличием в сыворотке антикоагулянтов, консервантов, бактерий, а также длительным хранением сывороток. Существуют несколько методов устранения антикомплементарности, но чаще всего используют метод обработки сывороток комплементом морской свинки. К 3 частям сыворотки добавляют 1 часть комплемента, оставляют при 4 °С на ночь, затем сыворотку прогревают 30 мин при 37 °С, разводят сыворотку физиологическим раствором 1 : 8 и прогревают 30 мин при 60 °С.

По материалам www.activestudy.info

Для выделения вируса может быть использована либо цельная дефибринированная, либо «лакйовая» кровь, либо кровь с антикоагулянтом. В последнем случае берут 5 мл крови в пробирку с 5-6 каплями гепарина и замораживают. После оттаивания гемолизированную кровь центрифугируют при 2-3 тыс. мин в течение 15 мин, добавляют пенициллин и стрепто­мицин из расчета 100-200 ЕД./мл и после проверки на стерильность используют для заражения. Для этих целей пригодна и свернувшаяся кровь. Ее растирают в ступке и добавляют небольшое количество раствора Хенкса (1:1 или 1:2).

Для серологической диагностики необходимо иметь сыворотки двух проб крови (парные сыворотки), взятых в начале и в конце болезни. Первую пробу берут как можно рань­ше — в инкубационный период или в начале проявления клиничес­ких симптомов болезни, вторую — во время выздоровления или через 2-3 нед после заболевания. Брать кровь и готовить сыворот­ку необходимо стерильно, нельзя применять антикоагулянты или консерванты, которые могут сделать сыворотку антикомплемен­тарной, а в реакции нейтрализации оказать инактивирующее дей­ствие на вирус или оказаться токсичными для культур клеток либо просто нестерильными. Кровь в объеме 10-15 мл берут в стериль­ные пробирки с резиновыми пробками, выдерживают при комнат­ной температуре до образования сгустка, обводят стеклянной па­лочкой (или другим инструментом) и переносят в холодильник при 4°С на 18-20 ч. После максимальной ретракции сгустка сыворот­ку отсасывают, добавляют антибиотики — пенициллин и стрепто­мицин по 100 ЕД./мл, проводят высевы на бактериологические сре­ды. Вместо отстаивания в холодильнике можно после обведения кровь центрифугировать.

Серологические методы вирусологической диагностики требуют исследования парных сывороток, поэтому необходимо правильно сохранять первые пробы, пока не будут получены вторые. Хранить сыворотки необходимо в холодильнике при 4°С или в заморожен­ном состоянии, строго соблюдая порядок нумерации и соответствия записей в журнале и пробах.

Известно, что вирус находится в клетке, поэтому в процессе приготовления рабочей суспензии из патматериала необходимо разрушить как можно больше клеток, чтобы извлечь из них максимальное количество вируса.

Для вирусологических исследований готовится 10% рабочая суспензия на физиологическом растворе. С этой целью в лаборатории из доставленного патологического материала отбирается в стерильную ступку 0,5-1,0 граммов из каждого кусочка паренхиматозных органов, мелко измельчается ткань стерильными ножницами, добавляется 0,2-0,5 грамма сухого стерильного речного песка или мелко измельченного стекла и стерильным пестиком тщательно растираются ткани.

При этом острые грани песка или стекла разрушают клетки, освобождая с цитоплазмой вирус.

Затем в ступку на каждый грамм растертой ткани приливается 9 мл стерильного физиологического раствора, получается 10% рабочая суспензия.

Содержимое ступки хорошо перемешивается и отстаивается 3-5 минут для оседания обрывков тканей, частиц песка или стекла.

Надосадочную жидкость осторожно сливают в чистые стерильные пробирки и при помощи воронки через обычный бумажный фильтр проводят фильтрацию рабочей суспензии в аналогичную посуду для освобождения суспензии от грубых взвешенных частиц.

Пробирки с приготовленной суспензией подписываются, ставятся в штативы и помещаются в холодильник при температуре +4 0 С до следующего занятия.

По материалам studfiles.net